很多時候，我們需要把細胞冷凍起來，以便于長期保存，以備不時之需。而復(fù)蘇，就是使冷凍的細胞蘇醒過來，恢復(fù)活力。
液氮罐廠家
其實，細胞凍存和復(fù)蘇的protocol教科書和實驗手冊上面都有。毛博我不想再重復(fù)了。這里，毛博根據(jù)自己做細胞培養(yǎng)近10年的經(jīng)驗和體會，談?wù)剳?yīng)該注意的一些事項和技巧，大部分都是血淚教訓和經(jīng)驗總結(jié)。都是干貨喲。
1冷凍越慢越好，復(fù)蘇越快越好
高大上的實驗室可以使用程序冷凍儀。一切由機器代勞。屌絲實驗室就只好用人肉程序冷凍儀。具體的protocol，到處都有。毛博想提醒大家的是，細胞冷凍越慢越好，寧慢勿快。做細胞冷凍前，事先留出充足的時間。
而復(fù)蘇速度越快越好。從液氮罐里取出來之后，迅速放在37°C水浴中，然后使勁搖呀搖。令其盡快融化。
2高高興興上班，平平安安回家
細胞凍存和復(fù)蘇是細胞培養(yǎng)技術(shù)里面最容易出事的部分。凡是和液氮接觸的操作，注意戴保護眼鏡和手套。最需要小心的是：復(fù)蘇的時候，在水浴中搖呀搖的時候。有時候小瓶會爆炸的。所以，一定要戴保護眼鏡和手套。不多說了，說多了滿眼都是淚。還有，凍存液中的DMSO是有毒致癌的。接觸的時候一定一定要帶好手套。
3凍存細胞數(shù)量要足夠
無論再怎么小心，細胞在冷凍和復(fù)蘇過程中總會死掉一批的。所以，一開始凍存細胞的數(shù)量要足夠。一般最低要達到5×106/毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個不能一概而論。有些細胞，比如雜交瘤細胞，只需要1-3x106/毫升。
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4做好標記
把培養(yǎng)瓶放入提手，末端應(yīng)該扎有小牌，注明主人的名字，細胞名稱和凍存日期。還要在每個凍存管上寫上細胞名稱，代數(shù)和凍存日期。
實驗室的液氮罐都是公用的。每個人應(yīng)該有屬于自己的提手。毛博當年就發(fā)生過為了找自己的細胞，被迫把整個液氮罐翻了個底朝天的慘劇。
5細心呵護
剛剛復(fù)蘇的細胞就象剛剛出生的baby，非常脆弱。需要我們的細心呵護。培養(yǎng)液要事先在培養(yǎng)箱或者水浴中復(fù)溫。一切的和細胞接觸的動作都要輕柔。把細胞從凍存管里吸出來，注入離心管，要輕輕地吸取和滴加。包括給離心管補加培養(yǎng)液的時候，都要輕輕地滴加。離心要用低速離心(500-1000轉(zhuǎn)/分鐘)。吹打要用專用的吹打管，而不要圖方便用移液槍，吹打也要輕輕的。
6DMSO的問題
上面提到了DMSO是一種有毒致癌物質(zhì)。那么，解凍之后，應(yīng)不應(yīng)該去除凍存液中的DMSO呢?答案是no。除了極少數(shù)特別注明的對DMSO敏感的細胞外，99%的細胞都不需要去除DMSO。解凍后的頻繁換液會慢慢去除掉DMSO的。
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7物離鄉(xiāng)貴，人離鄉(xiāng)賤
解凍后的細胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因為每一種細胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清，會造成細胞生長不良，甚至死亡。這和一個人突然離家千里，會水土不服是一樣的道理。
細胞培養(yǎng)是個苦活，根本離不開人。毛博還記得當年當實驗狗的時候，放個長假都要惦記著培養(yǎng)箱里面的細胞是不是該換液了。而掌握了有效的凍存和復(fù)蘇的技術(shù)，就可以解決這個問題。春節(jié)回家前把細胞都凍上，過了年回來再開干。
